Fijación
Aqui encontraras toda la información recopilada de fijación
La fijación es cualquier proceso fisico o quimicos que logra detener los procesos autoliticos, en corto y largo plazo. Evitando la perdida de las características claras de la morfología y consistencia del tejido (citoarquitectura). A la vez debe disminuir la dilución de las moléculas desde su ubicación original (insolubilizando los componentes celulares) e inánime los posibles agentes infecciosos.
El fijador debe ser fácilmente desechable o reciclable y admitir el almacenamiento de tejido a largo plazo.
No existe fijador ideal, ya que todos y cada uno poseen sus pros y contras.
Objetivos de la fijación:
- Preservar la morfología
- Preparación del tejido para los posteriores procedimientos (procesamiento, corte, inclusión)
- Conservar inmunoreactividad de antígeno (Es por esto que los tiempos deben ser controlados, porque se produce una enmascaración de anticuerpos si el tiempo es excesivo)
- Conservar ubicación de macromoléculas
Características de un buen fijador:
- Rápido: aun así los fijadores más rápidos no son los ideales por los daños producidos al tejido (alcohol, ácidos)
- Penetrante: este debe ser proporcional a la densidad del tejido, cuando la penetrancia es muy alta (alcohol) y el tejido es blando (tejido adiposo, como mama) se producirá que se vuelva quebradizo.
- Conservar detalles celulares: fundamentalmente el núcleo, donde se presentan principalmente las caracteristicas de malignidad de las células.
- Mordentaje: no produzca dificultades en los procesos posteriores
- No produzca artefactos: si se produce algun daño o artefacto en el tejido en este paso, no se pueden reparar.
- Insolubilización de componentes: asi nos permite reconocer la ubicación de la histoarquitectura
- Mantener osmolaridad (pH): se recomienda que sea levemente hipotónico, así se permite la entrada del fijador de forma más cómoda al tejido, por gradiente de concentración.
Factores de importancia:
- pH: se busca que los fijadores posean un pH similar al fisiológico (7-7,4) y así mantener la morfologia del tejido lo más parecida posible al "in vivo".
- Tamaño de la muestra: dependiendo de la penetración y velocidad del fijador se debe dar el tamaño de la muestra, aun asi se cumple generalmente un grosor de 2 cm.....
- Verificación de los tiempos de fijación por la muestra y el tipo de fijador (vida util).
- Volumen: siempre debe ser 20:1
- Temperatura de la fijación: esto puede acelrara o enlentecer el proceso, dependiendo del fijador que se utilice.
Consideraciones fisicas:
- Penetración
- Endurecimiento
- Contracción e hinchazón: esto se basa si es un fijador hipotonico (hinchazón) o hipertonico (contración).
Métodos de fijación:
Existen diferentes metodos para la fijación, aun asi en la clinica principalmente se ocupa:
- Inmersión: donde se sumerge la muestra en el fijador inmeditamente al ser extraida, limitando así la isquemia fría.
- Perfusión: se ocupa para órganos como los pulmones y animales pequeños. Se ingresa el fijador a través de los vasos sanguíneo, se introduce desde la arteria principal, aunque antes de introducir el fijador es de suma importancia introducir una solución de lavado oxigenada y así evitar los coágulos, también es de importancia la presión negativa.
- Por gas o vapor: esta en ocaciones se ocupa para histoquimicos, en donde se ocupa el vapor de paraformaldehido y tetróxido de osmio para tejidos liofilizados (no desnatura proteinas), eleimna el agua y el aire ya que trabaja al vacio, es el mejor metodod de fijación aun asi posee una maja penetración, por lo cual solo se pued eutilizar en muestras muy pequeñas. También se debe toman en consideración que tetroxido de osmio y paraformaldehido son extremadamente toxicos.
Métodos de fijación:
-Fisicos: Son todo aquel método físico que pueda mantener (preservar la histoartquitectura, detener procesos autoliticos) el tejido con métodos físicos. Estos se ocupan en menos cantidad que los métodos químicos, aun así son necesarios en algunos procedimientos.
Se divide en frio y calor.
Calor: se produce la coagulación de proteínas y evaporación de lípidos. No se utiliza como una fijación como tal ya que se utiliza el fijador junto al calor, y asi se disminuye los tiempos de fijación, llegando de 12 hrs a 20 min. Aunque estos poseen su consecuencia como núcleos deformados y encogidos, citoplasma coagulado.
Se debe tener en consideración que la formalina a altas temperaturas entrega vapores toxicos por lo cual se debe ocupar en campana de seguridad, aun asi se recomienda utilizar fijadores a base glioxal, este no forma vapores cuando se calienta a 55C. La muestra no puede exceder 3 cm de grosor y al sacarlo del microondas se debe cortar a 2mm y pasar por etanol 70%.
Cuando se trabaja con microondas se debe ocupar un posillo cuadrodo o rectangular, esto porque en pocillo redondo la energia se acumula en el centro, produciendo que el centro tenga una mayor temperatura provocando las reacción más rapido que en el resto del tejido.
Frio: se encuentra que este no es una fijación ya que no se produce uniones fisicas y no todas las proteínas se desnaturaliza.
Liofilización o criodesecación: Se ocupa para investigación. No se considera un método de fijación propiemente tal porque no insolubiliza las proteinas, aun asi deteiene los procesos autoliticos mientras duran las bajas temperaturas, cuando estas aumentan los procesos autiliticos vuelven a su normalidad.
Se ocupa para estudiar moleculas pequeñas, deben ser cortes de secciones delgadas.
Se sumerge en isopentano que fue helado por nitrogeno liquido, donde el agua de la muestra se elimina en una camara al vacio. Después de esto la muestra puede ser fijada en formaldehido por inmersión o paraformaldehido por vapores.
Criofijación o criostato: es el metodo utilizado en biopsias rápidas, en donde se utiliza un microtomo de tipo rotativo, el cual esta dentro de un gabinete mecánicamente refigerado, por nitrógeno liquido u otro liquido.
Generalmente esto se realiza a menos -20 aun asi cada tejido posee su propia temperatura
- Quimico: los fijadores quimicos son aquellos que provocan cambios moleculares en el tejido, ya sea por la mezcla o promueven la reestructuración del mismo. Estos fijadores pueden modificar componenetes como; enzimas y lugares antigenicos.
De esto se pueden clasificar según su efecto sobre las proteinas: coagulantes y no coagulantes.
Coagulantes: produce un efecto directo sobre las proteínas, modificando su estructura terciara y estado coloidal. Esto por la competencia que existe entre el fijador y el agua hacia las proteínas, provocando la precipitación de la proteína. Me lo imagino con una guerra y como gana el fijador el agua se amurra, se va y provoca que todo se ponga duro por falta de agua xd
Conservando matriz célular (el soporte), endure excesivamente el tejido y entrega una mala preservación de los organelos. Producen una mayor permeabilidad.
Sales, ácidos (ácido pícrico)
No coagulante: interactúan con la proteínas, generando redes entrecruzadas entre ellas, llevandonos al citoplasma célular sea un gel insoluble conservando los organelos. Esto produce una contración en el interior de la células (este es un artefacto).
Formalina
Aditivo: Son fijadores con gran presencia de iones (cloruro de calcio, tiocinato de potasio, sulfato de amonio, dehidrogenosfosfato de potasio) los cuales interactúan de forma directa con las proteínas. Provocando la desnaturalización o insolubilización de estas, formando reticulación (la reticulación impide la penetración de parafina, aumenta la fuerza física del tejido).
Sales, Formalina
No aditivo: Interactúan con moléculas de agua de las proteinas, causando su desnaturalización e insolubilización.
Alcohol, ácidos, acetona
No aditivo - coagulante : no posee efecto mordiente (tinción pobre) / alcohol, acetona, ácido acetivo,
Aditivo - no coagulante: se observa hermoso / formaldehido, glutaraldehido, gliosal
Aditivo - coagulante: mejor fijador estructural / ac. picrico
Mecanismo de acción de los fijadores químicos:
- Deshidratación tisular: son sustancias altamente higroscópicas (absorben agua), actuan directamente sobre el agua libre de la células (agua endogena es la que esta unida a la proteina y agua libre es la que esta en toda la célula). La proteina al no tener agua a su alrededor precipita ya que no poseen agua para mantener su tridimencionalidad o forma funcional por la ruptura de los puente de hidrogeno, esto genera alteración en la organización y estructura célular. Al tener una menor cantidad de agua en el tejido, por la eliminación de esta en la interacción con el fijador, provoca como artefacto problemas al teñir ya que será más lenta y opaca, por lo cual no es mordiente.
Alcohol etilico (no aditivo/ coagulante), acetona (no aditivo/ coagulante)
- Cambios en el estado coloidal de las proteínas: son sustancias que posee un pH ácido, en el cual al tener contacto con el tejido, se provoca el cambio del punto isoelectronico, provocando que la porteina pueda modificar su forma, disociándose totalmente.
Ácido acético (no aditivo / coagulante)
- Formación de sales: son fijadores que en su mayoria son metales, y actuan sobre los elementos ácidos como grupo carboxilos. Se forman por un catión metálico + ácido. La mayoria son aditivos coagulantes (ác picrico, zinc, ac. cromico).
Son buenos mordientes y son excelente para detalles célulares. Aunque producen un precipitado metálico, por lo cual no se pueden ocupar en tinciones en las cuales se con sales (como la plata). Provocan un endurecimiento.
- Reticulación proteica o formación de puentes de metileno: provocan la ruptura masiva de puentes de hidrogeno, por lo cual interactuan directamente sobre la proteína, el grupo amino expecificamente.
Forman enlaces cruzados entre las proteinas, por los restos proteicos indivicuaes dentro de ácidos nucleicos y las proteinas, a la vez elimina el agua libre entre los tejidos por lo cual precipitan las proteinas.
Folmaldehido y glutaraldehido.
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